艾灸通过调节滑膜G蛋白偶联受体43和辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡改善佐剂性关节炎大鼠滑膜炎的研究
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA)是一种以进行性关节破坏和高致残率为特点慢性炎症性疾病，并常伴有一系列关节外表现，包括心血管疾病、肺部疾病、胃肠道疾病等，是一个重要的公共卫生问题。
艾灸作为传统的外治方法，治疗RA较为安全，几乎无副作用，且具有抗炎和免疫调节的作用，目前研究发现艾灸能够通过辅助性T细胞17（helper T cell， Th17）/调节性T细胞（regulatory T cell， Treg）平衡改善RA关节症状。
G蛋白偶联受体43(g-protein-coupled receptor 43，GPR43)是一种重要的短链脂肪酸受体，在肠道、脂肪组织和免疫系统中均有表达，参与调节食欲和胃肠道肽分泌以调节脂肪分解和形成。
研究表明，GPR43的新型变构激动剂能够减轻炎症，支持了其作为治疗药物对各种炎症性疾病的临床实用性，且GPR43能够调节外周来源的Treg水平。
Treg和Th17与RA疾病活动密切相关，Treg可通过分泌具有抗炎信号传导特性的抑制性细胞因子来影响免疫耐受，降低炎性反应，如白介素-10（Interleukin 10，IL-10）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）；而Th17细胞能够分泌白介素-17（interleukin 17，IL-17)，引发滑膜的炎性反应。
但目前艾灸是否能够通过GPR43调节Th17/Treg平衡并未得到验证，故本研究建立 AA 大鼠模型，观察艾灸“足三里”“肾俞”对 AA 大鼠滑膜组织GPR43相对表达量，外周血Th17/Treg，血清IL-10、TGF-β1水平的影响，探讨艾灸治疗RA的可能机制。
健康雄性Wistar大鼠24只，体质量（190~210）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供[生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001]。
动物饲养于安徽中医药大学动物实验室，实验室温度为21~25 ℃、湿度为 40% ~60%，食用正规鼠用饲料及灭菌自来水。
适应性喂养7d后采用随机数字表法将24只Wistar大鼠分为正常组、模型组、艾灸组，每8只。
本研究经安徽中医药大学实验动物伦理委员会的批准(伦理编号：No.AHUCM-rats-2022139)，实验严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。
20%乌拉坦溶液（上海源叶），弗氏完全佐剂（CFA，美国Sigma），苏木精染液、醇溶伊红染液（安徽Ebiogo），乙级染色剂（德国Electron Microscopy Sciences），戊二醛、锇酸（美国Ted Pella Inc），GAPDH（北京Zsbio），GPR43（英国Abcam），藻红蛋白（PE）标记的分化决定簇抗原3 （CD3 ）、异硫氰酸（FITC）标记的分化决定簇抗原4（CD4 ）、
别藻蓝蛋白（APC）标记的白介素-2受体α亚基（CD25 ）、藻红蛋白（PE）标记的叉头框蛋白P3（FOXP3 ）、核内染色套装（美国Biolegend），IL-17A-APC（美国Thermo），大鼠IL-10、大鼠TGF-β酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（武汉基因美科技）。
YB-7LF生物组织包埋机（湖北亚光），ZT-12M生物组织自动脱水机（湖北亚光），CX41显微镜（日本Olympus），JEM1400透射电镜（日本电子），morada G3数码相机记录图像（德国蒙斯特），pH计（上海梅特勒-托利多仪器），自动曝光仪（上海培清科技），流式细胞仪（美国Beckman），RT-6100酶标仪（深圳雷杜），JW3021HR离心机（安徽嘉文），足容积测量装置（20 mL的无活塞注射器和5 mL的完全注射器之间用一根胶管相连）。
模型组和艾灸组采用风、寒、湿环境因素+ CFA注射的方法复制 AA 模型：将大鼠放置在自制造模箱内，使箱内温度(6±2)℃，湿度80%~90%，风力定于高档，持续20 d(12 h/d，20:00-8:00)，第21天于大鼠右后足趾部注射CFA(0.5 mL/只)致炎。
观察3 d，至24 h大鼠双侧足趾炎性肿胀和颜色改变，48 h后出现双侧肢体或前肢、耳、尾部炎性结节或红肿，表明造模成功。
正常组大鼠常规饲养，不做任何处理。
模型复制后第7天，艾灸组进行干预，穴位定位参照《实验针灸学》，大鼠剪去被毛，标色后，将其放置在特制悬空木架上固定，用艾条（直径 0.5 cm、长度 20 cm，南阳市卧龙汉医艾绒厂）距穴位2 cm处悬灸，依次灸双侧“足三里”“肾俞”，刺激20 min，1次/d，7 d为1个疗程，共3个疗程。
正常组和模型组只进行相应抓取固定，不做其他干预。
关节肿胀度（joint swelling degree，JSD）测量：分别于干预前 1 d和干预最后 1 d，采用自制排水法测量各组大鼠右后肢踝关节转折以下的足趾容积。
计算其足跖肿胀度：JSD（%）=（Vt-Vn）/Vn×100%（Vn、Vt分别代表致炎前后足跖容积）。
关节炎指数（arthritis index，AI）评分：分别于干预前 1 d 和干预最后 1 d观察并记录。
按 5 级评分法评价：所有关节均无红肿，0分；小趾关节红肿，1分；趾关节和足跖肿胀，2分；踝关节以下的足爪肿胀，3分；包括踝关节在内的全部足爪肿胀，4分。
各关节积分求和即为大鼠的 AI 评分，总分为0 ~16分。
取材方法：干预结束后次日，每组取6只大鼠，腹腔注射20%乌拉坦溶液（0.5 mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血3 mL，其中一部分用于流式细胞术，剩余部分离心20分钟左右（2000~3 000 r/min）分离血清，用于酶联免疫吸附测定法检测。
手术剪分离取出踝关节软骨下附着的淡黄色光滑透亮的滑膜组织。
一部分供HE染色和透射电镜观察，其他液氮冻存用于蛋白质印迹检测。
HE染色观察滑膜组织形态变化：取出部分滑膜组织，放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片（厚度约4 µm），脱蜡、乙醇脱水。
苏木素浸染2~5 min，流水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗，饱和碳酸锂溶液蓝化数秒，流水冲洗，乙醇脱水，伊红染液浸染数秒，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，×400光学显微镜下观察滑膜细胞增生及炎细胞浸润情况。
透射电镜观察滑膜组织形态变化：取部分滑膜组织，2.5%戊二醛固定24 h，PBS缓冲液浸泡6 h，1%锇酸固定2 h后常规脱水包埋，45 ℃烤箱12 h、72 ℃烤箱24 h，制成超薄切片（片厚70 nm），铜网捞片，电子染色。
JEM1400型透射电镜观察滑膜组织超微结构。
Western blot法检测滑膜组织中GPR43蛋白表达：取备用滑膜组织样本（约0.1 g左右），加入RIPA细胞裂解液，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热15分钟，冷却后，将样品每孔加5~10 µL，恒压80 V电泳，1 h。
转膜，封闭，加入一抗GPR43（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），4 ℃过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶20 000），室温孵育1.2 h，再次洗膜后使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。
Image J软件进行条带的分析。
以GAPDH作为内参量，计算GPR43蛋白的相对表达量。
流式细胞术检测外周血Th17和Treg百分比：腹主动脉取全血，加入相应的抗体，Th17(CD3，CD4)，Treg(CD4，CD25)，避光孵育15 min。
检测Th17细胞加入固定剂和破膜剂后加入适量的IL-17A；检测Treg细胞加入破核剂后加入适量的FOXP3，常温避光20 min。
用PBS洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测，FlowJo_V10分析Th17和Treg百分比。
ELISA法检测血清IL-10及TGF-β1水平：腹主动脉取血，离心20分钟左右（2 000~3000 r/min）分离血清。
严格按ELISA试剂盒说明书依次进行标准品及样品加样、加酶、温育、配液、洗涤、显色等操作，于450 nm波长测定各孔吸光度值，依照标准曲线方程计算血清中IL-10、TGF-β1含量。
采用SPSS26.0软件进行统计分析，Graphpad 8.0.1作图。
采用均数±标准差（x±s）表示符合正态分布的数值变量资料，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用 LSD 法，方差不齐时则采用 Tamhanes T2 法。
以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。
造模后与正常组相比，模型组和艾灸组大鼠JSD、AI评分均显著升高（P＜0.01），治疗后与模型组相比，艾灸组大鼠的JSD、AI评分明显降低（P＜0.01）。
采用HE染色和电镜评价艾灸对AA大鼠踝关节滑膜组织的影响。
正常组大鼠滑膜细胞排列整齐，未见炎细胞浸润；模型组大鼠滑膜细胞排列不整齐，增生活跃，有大量炎细胞浸润；艾灸组大鼠滑膜细胞略有增生，浸润炎细胞较模型组明显减少。
正常组大鼠踝关节滑膜细胞中细胞核膜核膜光滑完整，核染色质相对致密均匀，线粒体形态规整、嵴突可见；模型组大鼠踝关节滑膜细胞中细胞核膜不清晰、不完整，染色质固缩，细胞质内线粒体肿胀、嵴被破坏；艾灸组滑膜细胞核膜较清晰光滑、核染色质固缩不明显，线粒体肿胀不显著、嵴突可见。
实验结果显示，模型组AA大鼠滑膜组织中GPR43蛋白表达较正常组降低（P＜0.01）；艾灸组AA大鼠滑膜组织中GPR43蛋白表达较模型组升高，艾灸能够提高AA大鼠滑膜组织中GPR43蛋白表达（P＜0.05）。
为了阐明艾灸对AA大鼠炎性反应的影响，我们检测了大鼠的血液指标。
流式细胞术结果显示，与正常组比较，模型组AA大鼠外周血中Treg百分比降低，Th17百分比升高（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组AA大鼠外周血中Treg百分比升高，Th17百分比降低（P＜0.01）。
我们进一步检测了AA大鼠血清中IL-10、TGF-β1的水平。
数据显示，模型组大鼠血清IL-10、TGF-β1含量较正常组降低（P＜0.01）；艾灸组大鼠干预后血清IL-10、TGF-β1含量较模型组升高（P＜0.01）。
滑膜组织GPR43表达与外周血Treg表达的相关性分析，结果显示滑膜组织GPR43相对表达量与外周血Treg百分比存在线性相关关系（r=0.967，P＜0.01）。
类风湿关节炎（RA）属“痹证”范畴，与中医古籍中所提到的“历节”“鹤膝风”等症状相似。
《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”，认为是风寒湿邪是痹证的重要病因病机，这奠定了中医治疗痹症的理论基础，又有《中藏经·论骨痹》：“骨痹者，乃嗜欲不节，损肾也”，《脾胃论》：“内伤脾胃……为诸湿痹”，可见RA与脾胃肾关系密切。
故本研究所选穴位为“足三里”与“肾俞”，足三里是胃腑之下合穴，是与免疫系统相关的重要穴位，具有补益气血、扶正祛邪的作用；肾俞则为肾经经脉之气输注于背部之处，可补肾纳气、强筋健骨。
研究表明，近年艾灸治疗寒湿痹阻型RA常用的腧穴以温阳补肾、祛湿散寒为主，主要包括足三里、肾俞、阿是穴等。
且本课题组前期研究发现艾灸足三里、肾俞等穴位可调节免疫炎性反应，改善骨破坏，从而减轻RA的患者临床症状。
Th17细胞的主要效应细胞因子是IL-17、IL-22，它们通过刺激抗菌肽和趋化因子的产生来吸引白细胞，引起自身免疫反应。
Treg细胞可通过分泌IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子，抑制多种免疫细胞活性，从而发挥免疫抑制作用。
这两种细胞在分化上相互抑制，在功能上相互拮抗，Th17细胞引起自身免疫，而Treg细胞抑制自身免疫，两者共同维持机体免疫平衡，因此，Th17和Treg细胞的相互生成至关重要。
研究表明Treg在RA的发病机制中具有关键作用，其作用机制可能是通过产生一系列细胞因子（IL-10，TGF-β）抑制活化的免疫细胞。
本研究发现 AA 模型组大鼠外周血Treg百分比较正常组降低，艾灸组AA大鼠外周血Treg百分比较模型组升高，这与以往的研究结果一致。
GPR43参与炎症发生过程，是RA重要调节因子，它能够降低IL-6、IL-8的表达，并呈剂量依赖性。
且GPR43被短链脂肪酸(short-chain fatty acid， SCFAs)激活后，能够使Treg增殖和抑制能力增强，包括产生IL - 10。
这些发现表明GPR43在调节RA发病机制方面具有重要的潜在能力。
本研究结果表明，与正常组相比，模型组大鼠JSD、AI评分、外周血Th17百分比升高，外周血Treg百分比、滑膜组织GPR43蛋白表达及血清IL-10、TGF-β1含量降低；与模型组相比，艾灸组大鼠JSD、AI 评分、外周血Th17百分比降低，外周血Treg百分比、滑膜组织GPR43蛋白表达及血清IL-10、TGF-β1含量升高，且滑膜组织GPR43相对表达量与外周血Treg百分比呈正相关关系。
综上，艾灸“足三里”“肾俞”可能是通过GPR43调节Th17/Treg平衡，促进抑炎细胞因子IL-10、TGF-β1的分泌，从而改善 AA大鼠关节症状。
研究表明，SCFAs可能通过GPR43将信号传输给免疫细胞，促进初始T细胞向Treg细胞分化，增强Treg细胞的免疫抑制功能，发挥抗炎作用。
本研究亦观察到AA大鼠GPR43的变化，因此艾灸是否通过影响SCFAs调节Th17/Treg平衡发挥治疗作用，还需进一步综合研究。
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